1、酶切位点的距离太小（小于p），影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。
2、方法：
3、一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）
4、实验后继应用的所有载体(真核、原核、酵母、昆虫)都尽可能含有所选的酶切位点．并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点。）
5、尽可能选比较常用的酶切位点。
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